ELISA方法的建立中包被濃度的問題

包被濃度一般通過方陣ELISA來確定。

經(jīng)典的方陣ELISA是將抗原和抗體各自稀釋成不同梯度濃度，結(jié)果將OD值P/N>2的均判為陽性，選取OD值在1.0左右的那個Ag-Ab濃度為*佳工作濃度，

但是，對于抗原抗體而言，由于它們被稀釋成不同濃度，那么在理論上，每個抗原稀釋度下，總有一個抗體的稀釋度其OD值在1.0左右，那么到底選取哪一個OD值1.0左右的好呢？這就需要同時用**做個抑制來看，也就是說,每個抗原抗體稀釋度下,需要同時做間接及間接競爭ELISA.哪個濃度下抑制情況好，就取哪個抗原抗體濃度做工作濃度.

ELISA問題我總結(jié)了一下,你們可以去看看.

我碰到過所有孔都一樣藍(lán)的情況，從兩方面找原因了：

一是調(diào)整酶的濃度。ELISA反應(yīng)中酶是關(guān)鍵因素之一，酶濃度高會導(dǎo)致P/N比拉不開。處理：在別的條件不變的情況下，對酶做梯度稀釋，10倍一個梯度。酶稀釋到了合適的濃度，結(jié)果一下就好看了。

二是排除封閉不好的問題。我用過自己配的BSA封閉和國外試劑盒配的封閉液，雖不是天上人間的差別，至少也是清晰與模糊的距離。這個雖然不是關(guān)鍵問題，在試驗不好又找不到突破的時候，也別放過可能的失誤吧。

你可以通過方陣實驗，確定抗原抗體的*佳結(jié)合濃度。

具體的方法：將抗原稀釋成不同梯度的濃度包被，抗體也稀釋成不同的濃度梯度，加二抗，顯色。一般選OD值在1.0左右的抗原抗體結(jié)合濃度。

你還有什么具體的要求，說清楚一點，再幫你解答。

逐點分析啊：

就你包被的單抗來說，對于標(biāo)準(zhǔn)品來說已經(jīng)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量了，所以這個梯度對于你的實驗來說，沒有起到相應(yīng)的作用。

標(biāo)準(zhǔn)品的總梯度也不夠大，不過8倍而已，建議增加梯度。同理一抗的梯度，因為如果你的蛋白比較大，即使是1：2000稀釋也足以結(jié)合掉所有的標(biāo)準(zhǔn)品了，板子一片藍(lán)也就不可避免了。

另外關(guān)于封閉液，不知你用的是什么，如果是BSA應(yīng)該不會有問題。

把生物素二抗加HRP 的系統(tǒng)直接換成了HRP結(jié)合的二抗，結(jié)果不是一片藍(lán)了，可看出濃度梯度。但是空白還是比較高，OD值在0.3--0.6左右。結(jié)果樣本測定均小于空白值。

重新用10%FBS封閉過夜，結(jié)果BSA PBS孔（空白對照）為0.373, PBS孔0.45, FBS PBS 孔0.309。樣本還是大部分低于空白。但是如果樣本以FBS 孔為空白（樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清，都含有10%FBS)，則部分樣本有結(jié)果。